叶酸—壳聚糖纳米载体的制备及其靶向作用研究

【摘要】壳聚糖(CTS)是一类重要的尚未高效利用的天然高分子。本文依据静电相互作用的原理,以壳聚糖和叶酸为原料,采用离子交联法制备了叶酸-壳聚糖纳米粒及载药纳米粒。利用红外光谱(IR)、激光粒度分析仪、透射电子显微镜(TEM)和zeta电势表征了纳米粒的化学结构、平均粒径、分散指数和外貌形态特征。测定了药物的包封率、载药率、体外释放速率、稳定性、体内外抑瘤活性、器官靶向性、平均滞留时间。本研究不仅改善了叶酸-壳聚糖纳米粒的制备方法,而且使其载药范围扩大,所得载药纳米粒既具备载药率高、包封率高、稳定性好的特点,又具有靶向缓释的显著特性,为壳聚糖资源的合理利用提供基础数据和技术支持。具体研究内容及结果如下：以壳聚糖为载体、叶酸(FA)为靶向配体、三聚磷酸钠(TPP)为聚阴离子,在水相中,利用阴阳离子间的静电相互作用,采用离子交联法一步合成了空白(不载药)叶酸-壳聚糖纳米粒(CTS-TPP-FA)。红外光谱(IR)证实叶酸与壳聚糖是以离子键结合的。以纳米粒粒径(小于200nm)为指标,考察了对纳米粒粒径的影响因素,得到最佳制备工艺为：在水浴55℃、滴加速度1d/s、搅拌速度900-1OOOr/min条件下,以VmL浓度为2.0mg/mL的壳聚糖醋酸溶液(醋酸浓度为1%,此时pH值为3.95)为底液,先向其滴加V/4mL浓度为1.0mg/mL的叶酸氨水溶液,然后向其滴加V/10mL浓度为2.0mg/mL的三聚磷酸钠溶液,滴加完毕,继续搅拌10分钟,得空白叶酸-壳聚糖纳米粒水分散体系,离心,冻干,得空白叶酸-壳聚糖纳米粒。在最佳制备工艺条件下,所得纳米粒为球形,大小均匀,水合平均粒径为145nm,分散指数为1.019。在空白纳米粒制备基础上,以包封率为指标,综合考虑载药率及粒径大小,考察了药物的加入方式及加入量对包封率及载药率的影响,结果表明：对于羟基喜树碱(HCPT),先使HCPT与壳聚糖醋酸溶液以3：10(羟基喜树碱：壳聚糖,w/w)比例混合。对于阿霉素(DOX),先使DOX与TPP生成聚电解质,然后按空白纳米粒的制备方法制得载药纳米粒(HCPT/CTS-TPP-FA和DOX/CTS-TPP-FA)。所得HCPT/CTS-TPP-FA纳米粒平均粒径为150nm,包封率、载药率分别为89.90%、19.80%,体外累积释药率24h可达87%,其释放规律符合Higuchi方程,纳米粒表面带正电荷,电位值为+50.1mV,粒度稳定性较好,放置数十天粒径几乎无变化。所得DOX/CTS-TPP-FA纳米粒平均粒径为162nm,包封率、载药率分别为91.00%、21.50%,体外累积释药率5d可达28.25%,其释放规律符合Higuchi方程。纳米粒表面带正电荷,电位值为+52.1mV,粒度稳定性好,放置数十天粒径几乎无变化。从粒径大小及所连接叶酸的量推断,以上两种纳米粒子具有很好的肿瘤靶向性。体外细胞实验考察了载羟基喜树碱纳米粒对人肝癌细胞HepG-2、人肺癌细胞A549及人乳腺癌细胞MCF-7的生长抑制作用。经MTT法检测,结果表明：HCPT/CTS-TPP-FA对肝癌、肺癌、乳腺癌细胞的生长均具有明显的抑制作用,其抑制率随药物浓度、作用时间的增加而升高,具有时间和剂量依赖性。HCPT/CTS-TPP-FA的抗肿瘤作用优于HCPT/CTS-TPP,与对照组相比差异显著(P<0.01),证实HCPT/CTS-TPP-FA具有良好的肿瘤靶向作用。体内动物实验考察了纳米粒对荷S180肉瘤小鼠的抑瘤率的影响,结果表明：含叶酸的纳米粒HCPT/CTS-TPP-FA抑瘤率为52.91%,高于不含叶酸的纳米粒HCPT/CTS-TPP抑瘤率40.06%,说明HCPT/CTS-TPP-FA具有良好的肿瘤靶向作用。采用HPLC法测定载羟基喜树碱纳米粒在小鼠的血及心、肝、脾、肺、肾等组织器官中HCPT的含量,分析药物靶向效率(Te)、药物相对靶向效率(Re,相对摄取率)和峰浓度比(Ce),考察HCPT/CTS-TPP/FA在小鼠体内的器官的靶向性和平均滞留时间。结果表明,HCPT/CTS-TPP-FA对肝癌、血癌、肺癌的治疗效果比临床常用的HCPT钠盐注射剂要好,体现了HCPT/CTS-TPP-FA纳米粒具有靶向、缓释的特性,临床上有望成为羟基喜树碱治疗肝癌、肺癌、白血病等肿瘤的新剂型——肿瘤靶向药物制剂,对研究其他抗肿瘤药物的靶向、缓释新剂型具有重要的理论指导意义。为了增加纳米粒的稳定性,便于储存和使用,本研究以葡萄糖和甘露醇为冻干保护剂,应用冷冻干燥技术,制备HCPT/FA-CTS-TPP纳米冻干粉。以冻干粉外观及再分散性为指标,考察了冻干保护剂种类及浓度,冻干保护剂的量和冻干保护剂的加入方式等因素对冻干粉外观及再分散性的影响。结果表明：采用外加法,向HCPT/FA-CTS-TPP纳米水分散体系中加入等体积,浓度为8%的甘露醇水溶液,所制备的冻干粉针剂呈完整的饼状,颜色均一,外表光滑,结构致密,松脆,在水中有很好的分散性,分散快且无任何不溶物。综上研究结果表明,以壳聚糖在酸性条件下衍生化为阳离子高分子化合物,先与叶酸靶向配体结合,再与聚阴离子三聚磷酸钠交联制备的纳米粒具有良好的缓释及靶向作用,对研究以叶酸受体介导的药物(如抗炎药、抗癌药)的靶向缓释新剂型具有重要的理论指导意义。
【作者】邢志华；
【导师】方桂珍；
【作者基本信息】东北林业大学，林产化学加工工程，2014，博士
【关键词】载羟基喜树碱纳米粒；载阿霉素纳米粒；壳聚糖；叶酸受体；靶向给药系统；

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